第二节 DNA片段的扩增——PCR技术

[课标要求]1.理解pcr的原理，讨论pcr应用。2.尝试pcr技术的基本操作。[知识梳理]一.背景知识1.细胞内dna复制步骤：（1）在           作用下解开dna双链(2)在           作用下，以dna单链为模板，合成一段           ;（两条dna模板链各需一个rna引物）(3)以rna引物为起点，在         作用下，以          为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新链。2.聚合酶链式反应(pcr)概念;                                                                                                                                  。3.pcr过程与细胞内dna复制过程区别：（1）引物是人工合成的       单链，20－30个脱氧核苷酸，而不是rna。(2) 解旋通过对反应       的控制来实现而不依靠             。4.pcr过程：(1)将pcr缓冲液、         、一对引物、四种         、dna聚合酶、mg2+等成分加入到特制的微量离心管中。(2)高温变性：                                                                                                                                 。(3)低温复性：                                                                                                                                 。(4)中温延伸：                                                                                                                                 。二.实践案例1.pcr实验虽然原理复杂，但操作十分简单，因为生物制剂公司已把pcr缓冲液、dna聚合酶、脱氧核苷酸贮备液等组分配成了pcr试剂盒，实验人员仅需加入模板dna及引物即可，所以快速、高效、灵活和易于操作是pcr技术的突出优点。2.材料用具略3.活动程序(1)加入各种试剂，混合，离心10s，放入pcr仪中。 (2)扩增循环，在pcr仪上设置好pcr热循环程序：循环数高温变性低温复性中温延伸第一次95℃,5min55℃,1min72℃,1min30次95℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次­­  ————72℃,7min注：反应产物在4℃保存4.检测扩增效果（1）稀释样品10倍（2）以h2o作对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调到零。（3）加入到厚度为1cm的比色杯中，测定260nm处的光吸收值（4）dna浓度（μg/ml）=（a260nm/0.02）×稀释倍数三.探究活动 pcr实验虽然操作简单，但实验设备及药品价格较高，可以利用自己准备的简易材料，设计并进行pcr技术的模拟实验操作。 四.pcr技术意义pcr能                                                  ，从而有效地解决了因为样品中dna含量      而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对dna分子的分析和检测能力，被广泛应用于           、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等。五.小知识：1.dna的两条链是反向平行的，为了明确地表示dna的方向，通常将dna的羟基(-oh)末端称为5’端。dna聚合酶不能从头开始合成dna，而只能从3’端延伸dna链。但dna合成的方向是从子链的5’端向3’端延伸。2.引物是一段rna，它能与dna母链的一段碱基序列互补配对。用于pcr的引物长度通常为20—30个核苷酸。3.在80ºc—100ºc的温度范围内，dna的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的dna链又会重新结合成双链。[复习指导]本节课复习要注重细胞内dna复制过程和体外dna片段的扩增——pcr技术的过程，运用dna复制过程原理相同的方法，明确体外dna片段的扩增——pcr技术在基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等方面的地位和作用。如何在体外创设细胞内dna复制的条件是pcr技术的关键，细胞内的各种条件实际上是利用pcr仪来模拟的。pcr仪原理复杂，操作简单。[典例解析]1.pcr过程与细胞内的dna复制过程相比，主要有两点不同，它们是（  ）①pcr过程需要的引物是人工合成的dna单链②pcr过程不需要dna聚合酶③pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的④pcr过程中，dna不需要解旋，直接以双链dna为模板进行复制    a.①②③④       b.①②          c.①③         d.②④[解析]pcr过程与细胞内的dna复制过程相比，主要有两点不同。第一，pcr过程需要的引物不是rna，而是人工合成的dna单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。第二，pcr过程中，dna解旋不依赖解旋酶，而是通过对反映温度的控制来实现的。 [答案]c。2.在pcr扩增前，需要将下列哪些物质加入微量离心管中？（  ）①模板dna②模板rna③dna解旋酶④耐高温的dna聚合酶⑤引物 ⑥pcr缓冲液⑦脱氧核苷酸贮备液⑧核苷酸贮备液a.①④⑤⑥⑦              b.①③④⑤⑥⑧ c.②③④⑤⑥⑦            d.①④⑥⑦⑧[解析]进行pcr过程前，将pcr缓冲液、dna模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、dna聚合、mg2+等成分加入到一种特制的微量离心管中。[答案]a